航欄/MA-logo.png){kind=logo}
航欄/CNAS.png)
航欄/GLP.png)
航欄/MAR.png)
航欄/MA2.png)
航欄/掃碼關(guān)注.png)
發(fā)布時間：2021-12-30 15:05:55
染色體畸變試驗
可用末梢血淋巴細(xì)胞，或人和哺乳動物體細(xì)胞系作為材料，常用的體細(xì)胞系有中國地鼠卵巢細(xì)胞（CHO），中國地鼠肺成纖維細(xì)胞（V79和CHL），人胚肺2倍體成纖維細(xì)胞等。這里介紹外周血淋巴細(xì)胞為對象的染色體畸變的試驗方法。
實驗?zāi)康暮驮恚?/span>
染色體畸變分為染色體結(jié)構(gòu)畸變和數(shù)目畸變，染色體結(jié)構(gòu)畸變又分為缺失、短片、互換等。
在加入和不加入代謝活化系統(tǒng)的條件下，使培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞暴露于受試物中，用中期分裂相阻斷劑（如秋水仙素或秋水仙堿）處理，使細(xì)胞停止在中期分裂相，隨后收獲細(xì)胞，制片，染色，分析染色體畸變。
應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)
GB/T 16886.3 / ISO 10993-3 / ISO/TR 10993-33/YY/T 0127.16/YY/T 0870.2/YY/T 0870.5
方法與步驟
1. 試劑
1）RPMI-1640培養(yǎng)液，含20%小牛血清。
2）肝素：每支含肝素12500U，使用時用生理鹽水配成500U/ml，4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?nbsp;
3）秋水仙素：配成40ug/ml濃度。稱取秋水仙素4mg，溶解于100ml 0.85%Nacl 溶液中，經(jīng)6號細(xì)菌漏斗過濾，4℃冰箱內(nèi)保存。使用時吸取0.05或0.1ml加入到5ml細(xì)胞培養(yǎng)物中，其終濃度為0.4～0.8ug/ml。
4）雙抗：青霉素100U/ml，鏈霉素100ug/ml。
5）PHA:PHA為冰干注射劑（廣州生產(chǎn)）每支10mg，使用時用2ml生理鹽水溶解。
6）KCl低滲液：KCl 1.88g，雙蒸水1000ml使之溶解，其濃度為0.025M.
7）冰醋酸甲醇固定液：冰醋酸1份，甲醇3份，混合而成。
2. 細(xì)胞培養(yǎng) 常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)
3. 受試物的處理
實驗分組：至少設(shè)立五個組，即陽性對照、陰性（溶劑）對照及三個劑量組。最高劑量和最低劑量之間相差10倍，中間再設(shè)一個劑量，陽性對照物為已知的染色體斷裂劑，如絲裂霉素C(MMC)，劑量為0.02μg/ml；黃曲霉素毒素B1，濃度為10-6M等。每組中應(yīng)設(shè)2～3個平行樣品。
4. 操作步驟
1）收集細(xì)胞：經(jīng)受試驗處理的細(xì)胞，培養(yǎng)開始后52～72h收集細(xì)胞。依不同受試物而有所差異。 2）加入秋水仙素：培養(yǎng)終止前于培養(yǎng)物中加入40μg/ml秋水仙素0.05-0.1ml，終濃度為0.4～0.8μg/ml，37℃下培養(yǎng)4h。
3）低滲處理：小心取出細(xì)胞培養(yǎng)物，棄去上清液，細(xì)胞沉淀在瓶底（體細(xì)胞須經(jīng)胰酶消化），加入8ml
KCl低滲液，用滴管輕輕吹打制成細(xì)胞懸液，移入10ml刻度離心管中，37℃下處理20min。
4）離心：1000轉(zhuǎn)/min，離心7～10min，棄去上清液，收集細(xì)胞，加入Hanks液。
5）固定：加入1：3冰醋酸甲醇固定液3ml預(yù)固定，用滴管輕輕吹打，立即離心，收集細(xì)胞，再加入10ml上述固定液，處理15min，反復(fù)操作兩次，每次15min。
6）制片：棄去固定液，再加入適量新鮮固定液，混勻。取出預(yù)冷的載玻片，每片滴加1～2滴細(xì)胞懸液，用嘴輕輕吹散，或用滴管吸取少許細(xì)胞懸液，在40～50㎝高度上對準(zhǔn)下面玻片滴加懸液，以沖力使細(xì)胞分散。自然干燥或用微熱電吹風(fēng)機吹干，也可在酒精燈火焰上略加烘烤。此時可在顯微鏡下檢查有無分裂相細(xì)胞。
7）染色：用Giemsa 染液染色15min，用自來水輕輕沖洗殘留染液，待干。
8）鏡檢：先在低倍鏡下尋找分散良好的分裂相細(xì)胞，然后用高倍鏡或目鏡觀察，進(jìn)行染色體畸變計數(shù)，分析，分別記錄染色體畸變細(xì)胞數(shù)及各種類型染色體畸變細(xì)胞數(shù)，選擇良好的典型的染色體畸變圖進(jìn)行顯微照相。
5. 結(jié)果表示
1）染色體總畸變率及畸變率： 總畸變率（%）=各種畸變類型數(shù)/分析總細(xì)胞數(shù)×100 畸變率（%）=染色體畸變數(shù)/染色體總數(shù)×100
2）畸變類型分析：包括斷片（F）、雙著絲粒（D）、環(huán)（R）、互換（E）等，電力輻射常見斷片、雙著絲粒、環(huán)等，而化學(xué)毒物常見單體斷裂。
6. 注意事項
1) 接種的血樣要新鮮，如不立即培養(yǎng)，應(yīng)放在4～25℃溫度下，于24h內(nèi)作培養(yǎng)。
2) 培養(yǎng)箱溫度以37±5℃為宜。
3) 培養(yǎng)過程中如發(fā)現(xiàn)血樣凝集，可將培養(yǎng)瓶輕輕震蕩，使凝塊散開，然后繼續(xù)培養(yǎng)。
4) 如低滲處理不當(dāng)，染色體聚集一團，可將固定時間延長數(shù)小時或過夜，熱低滲過度，往往細(xì)胞全部破碎，造成染色體丟失。
5) 離心速度過快，細(xì)胞團不易打散，速度過低，則使分裂相細(xì)胞大量丟失。
6) 玻片要嚴(yán)格清潔，使細(xì)胞均勻鋪開。
周期
6-8周
送樣要求
ISO 10993標(biāo)準(zhǔn)： 固體或粉末狀： 6個完整樣品，每個樣品需60 cm2 或 4 g及以上； 液體或化學(xué)品：25ml及以上
GB 16886標(biāo)準(zhǔn)： 固體或粉末狀： 6個完整樣品，每個樣品需60 cm2 或 4 g及以上； 液體或化學(xué)品：25ml及以上
